Se realizó un estudio multicéntrico caso-control en los pacientes con SN corticoresistente causado por GFS idiopática, diagnosticada mediante biopsia renal. El estudio incluyó pacientes adultos y pediátricos atendidos en 4 centros hospitalarios entre enero de 2012 y marzo de 2019. Los criterios de inclusión fueron: resistencia a esteroides, diagnóstico histológico de GFS en la biopsia renal, ausencia de etiologías secundarias tras realizar un estudio sistemático y protocolizado, ausencia de antecedentes familiares de nefropatía y resultado negativo en el estudio genético. Además, se incluyeron solo pacientes que aún no habían recibido tratamiento con esteroides, inmunosupresores, bloqueadores del receptor de angiotensina II o estatinas en el momento de la obtención de muestras de sangre y orina. Las etiologías secundarias excluidas incluyeron reducción de la masa renal, obesidad mórbida, nefropatía asociada al VIH, consumo de heroína o cocaína, infección por parvovirus B19, consumo de analgésicos, bisfosfonatos o interferón, reflujo vesicoureteral y apnea obstructiva del sueño. Se realizó un estudio genético para descartar mutaciones patógenas en todos los pacientes con corticoresistencia menores de 35 años, mediante un panel renal previamente descrito y validado (Bullich G. et al., 2018).

El diseño constó de 2 fases: 1) una fase observacional caso-control para analizar la respuesta a los ICN y las variables asociadas, y 2) un seguimiento prospectivo de la cohorte de enfermos tratada, para evaluar la evolución de las variables estudiadas tras el tratamiento en función del resultado.

El SN idiopático (SIN) se definió por valores de excreción de proteínas en orina de 24h>3,5g/día en adultos y >40mg/m2/h en niños, asociado con hipoalbuminemia <3,5g/dl y edema. Después del diagnóstico, tanto el seguimiento clínico como los criterios de tratamiento se llevaron a cabo siguiendo las recomendaciones indicadas en las guías KDIGO15 a criterio de cada centro participante. Para poder ser incluido en el estudio, los criterios de corticoresistencia se definieron explícitamente y fueron los mismos para todos los centros. En los pacientes pediátricos, la resistencia a corticoides se definió como la falta de remisión completa (reducción de la relación proteína/creatinina en orina a <0,2mg/mg) después de 8 semanas de terapia con prednisona a una dosis estándar de 60mg/m2/día. En los pacientes adultos, la resistencia a corticoides se definió como la falta de remisión (reducción de la proteinuria a <0,3g/día, niveles de creatinina sérica estables y niveles de albúmina sérica >3,5g/dl) después de una exposición mínima de 16 semanas a prednisona a una dosis diaria de 1mg/kg o a una dosis en días alternos de 2mg/kg. No se incluyeron pacientes con remisión parcial a corticoesteroides; se consideraron únicamente como corticoresistentes aquellos pacientes que, según la definición, no alcanzaron remisión, independientemente de si presentaron una disminución de la proteinuria sin llegar al umbral establecido para remisión parcial. El tipo de ICN indicado (tacrolimus o ciclosporina), fue seleccionado libremente por cada uno de los centros participantes. Las directrices para el tratamiento en cuanto a dosis, niveles valle y controles, fueron las mismas en todos los centros y se basaron asimismo en las recomendaciones de las guías KDIGO15. Se consideró que había respuesta al tratamiento con los ICN si, tras el inicio del tratamiento se conseguía una remisión total o parcial de la proteinuria, de acuerdo con los criterios descritos en las guías KDIGO para los pacientes pediátricos y los adultos. Se consideró paciente pediátrico a los pacientes <18 años.

El grupo control incluyó a sujetos sanos pareados por edad y sexo, seleccionados de una base de datos electrónica que contiene datos demográficos de 450 donantes de sangre sanos y de individuos sanos en edad pediátrica, obtenidos de estudios preoperatorios de procesos dermatológicos o cirugía menor local. Todos los participantes en el estudio firmaron el consentimiento informado correspondiente antes de su inclusión. En el caso de los controles en edad pediátrica, las muestras de sangre fueron obtenidas tras consentimiento informado de sus padres o tutores. El estudio se realizó de acuerdo con los parámetros establecidos por la Declaración de Helsinki y la ley local de protección de datos personales (LOPD 15/1999). El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de bioética independiente de los centros participantes (código interno 2551).

Todas las muestras de sangre, suero y ADN se obtuvieron antes de iniciar cualquier tratamiento inmunosupresor o inmunomodulador. Las muestras de sangre se obtuvieron en tubos estándar sin aditivos, se centrifugaron a 1.500g durante 10min, y se almacenaron a −80°C hasta su uso. La creatinina sérica se midió mediante el método compensado trazable a IDMS (Hitachi Modular P-800 Roche Diagnostics, Alemania). La tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) se calculó utilizando la ecuación de Schwartz en niños y la fórmula de la Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI) en adultos. Los niveles séricos de CD25 se midieron mediante ELISA (Quantikine R&D Systems, Inc., MN, EE. UU.). Todos los análisis de ELISA se realizaron en el mismo laboratorio, por el mismo equipo y por duplicado. Además, para analizar la reproducibilidad de las mediciones, en una muestra de 15 pacientes se realizaron 3 o más determinaciones durante la fase de brote nefrótico, antes de iniciar cualquier tratamiento. En todos los casos, los coeficientes de variación de las mediciones repetidas fueron <10%.

El análisis de la activación linfocitaria, se realizó mediante citometría de flujo multicanal (Cytoflex Beckman Coulter, EE. UU.), incluyendo: subpoblaciones de linfocitos T (helper (CD4 DR+), citotóxicos (CD8 DR+) y células T reguladoras), receptor soluble de IL-2 (CD25) y porcentaje de linfocitos CD3 con expresión de CD25. Para ello, se utilizaron anticuerpos monoclonales conjugados con fluoróforos, específicos para cada marcador (Abyntek Biopharma, España).

Todas las biopsias renales fueron analizadas centralmente a ciegas por 2 anatomopatólogos experimentados que confirmaron el patrón morfológico de GFS caso por caso. Las biopsias renales se tiñeron con hematoxilina y eosina, ácido periódico de Schiff-metenamina y tricrómico de Masson para el análisis morfológico, y se realizaron estudios de inmunofluorescencia con anticuerpos contra inmunoglobulina A (IgA), IgG, IgM, C3, fibrinógeno y cadenas ligeras, y se procesaron para un estudio con microscopio electrónico.

Las variables cuantitativas se expresan como media±desviación estándar y las variables cualitativas como proporciones. Las comparaciones de medias entre grupos para datos independientes se realizaron utilizando la prueba t de Student o la U de Mann-Whitney, en caso de distribuciones no normales. La comparación de 2 medias intragrupo, se realizó mediante la t de Student para datos apareados o su equivalente, el test de Wilcoxon para variables no paramétricas. La asociación entre variables cuantitativas, se analizó mediante el coeficiente de correlación de Pearson o el de Spearman en función de la distribución de la variable. La comparación entre variables categóricas se realizó utilizando la prueba de Chi-cuadrado. Para analizar la normalidad en la distribución de los datos, se utilizaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov o Shapiro-Wilk. Se aceptó como valor significativo una p<0,05. Después de clasificar a los pacientes según la respuesta a los ICN, se realizó un análisis univariado para analizar las variables asociadas a remisión. Los valores de corte para las variables cuantitativas asociadas con la respuesta al tratamiento se calcularon mediante curvas ROC, utilizando el índice de Youden para seleccionar el valor óptimo. Los cálculos estadísticos se realizaron utilizando el programa SPSS®, versión 20.0.

Se incluyeron un total de 39 pacientes con GFS resistente a corticoides, 15 (38,5%) eran pacientes pediátricos (15±2 años) y 24 (61,5%) eran mayores de 18 años (38±17 años). El grupo control, incluyó a 23 controles sanos, de los cuales el 26,1% eran pediátricos con una edad promedio de 17±1 año y el 73,9% eran mayores de 18 años con una edad promedio de 34±12 años.

En la tabla 1, se resumen las variables demográficas, características clínicas y bioquímicas de ambos grupos. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a edad, sexo y TFGe entre los pacientes con GFS y los controles sanos. Sin embargo, los pacientes con GFS mostraron niveles significativamente mayores de CD25 soluble, expresión de receptores de IL2 en linfocitos T CD3 (CD3-IL2+), y DR en linfocitos CD4 y CD8, así como un mayor cociente CD4/CD8 en comparación con los controles (p<0,01).

En la tabla 2, se resume la matriz de correlaciones entre las variables relacionadas con la activación de los linfocitos T estudiadas, en el grupo total de enfermos con GFS. El nivel de CD25 soluble presentó una moderada asociación con la expresión de IL2 en linfocitos CD3 y más leve con la expresión DR en CD4 y CD8. Se apreció asimismo una asociación significativa entre el número total de linfocitos CD3 y el número de linfocitos CD8 DR+ y una asociación fuertemente negativa entre el número de linfocitos CD4 DR+ y el número de linfocitos CD8 DR+. En el grupo de controles sanos, no se apreciaron asociaciones significativas entre ninguna de las variables estudiadas (datos no mostrados).

La duración mínima del tratamiento con inhibidores de calcineurina fue de 6 meses, siguiendo las recomendaciones de las guías clínicas, con una media de 11,7±5,35 meses (rango: 6-24 meses), sin diferencias significativas en la duración entre ciclosporina A y tacrolimus (p=0,92). Sin embargo, al analizar según la respuesta o resistencia a los ICN, se observaron diferencias estadísticamente significativas: los pacientes respondedores recibieron más meses de tratamiento, mientras que, en los casos sin ningún tipo de respuesta, el tratamiento se interrumpió antes para evitar efectos secundarios no deseados ante la falta de eficacia (tabla 3).

De los 39 pacientes, 19 (48,7%) respondieron al tratamiento con ICN, de los cuales 12 (63,2%) lograron una respuesta parcial y 7 (36,8%) una respuesta completa. Los pacientes respondedores presentaron niveles estadísticamente significativos mayores de CD25 soluble, número absoluto de linfocitos CD3 y expresión de IL-2 en linfocitos CD3, y una menor expresión de DR en linfocitos CD8, en comparación con los no respondedores (p<0,05, tabla 3).

Al comparar el grupo de pacientes que respondieron al tratamiento con ICN, diferenciando entre aquellos con remisión parcial y completa (tabla 4), se observó que los pacientes con remisión completa eran significativamente más jóvenes, mientras que no se encontraron diferencias importantes en el resto de las variables estudiadas (tabla 4).

El análisis de los niveles de CD25 mostró diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes GFS respondedores y los controles (477±84 vs. 262±62pg/ml, respectivamente; p<0,01). En contraste, no se encontraron diferencias significativas entre los GFS no respondedores y los controles (290±86 vs. 262±62 pg/mL, respectivamente; p=0,31).

La cohorte pediátrica incluyó un total de 15 pacientes, de los cuales el 52,4% eran de sexo masculino. La edad media fue de 14,7±2,1 años. Al comparar las características demográficas, clínicas y bioquímicas entre la población pediátrica y adulta, no se observaron diferencias significativas. Asimismo, no se identificaron diferencias en los niveles séricos de CD25 soluble, en la proporción de linfocitos CD3 con expresión de IL-2 ni en el resto de las subpoblaciones linfocitarias analizadas.

En cuanto a la respuesta al tratamiento con los ICN, el 53,3% (n=8) de los pacientes pediátricos lograron criterios de respuesta. De estos, el 87,5% (n=7) alcanzaron remisión total del SN, lo que representa una diferencia estadísticamente significativa en comparación con la población adulta, donde ninguno de los pacientes alcanzó remisión completa (p<0,01).

De las variables estadísticamente significativas del estudio bivariante se realizó un modelo de regresión logística binaria donde se obtuvo únicamente como modelo final significativo la variable CD25.

La curva ROC mostró una AUC de 0,937 e identificó un punto de corte de 324pg/ml para CD25 soluble, con una sensibilidad del 94%, especificidad del 75%, valor predictivo positivo el 78% y valor predictivo negativo del 94% (fig. 1).

Figura 1.

Curva ROC del CD25 soluble.

Tras un seguimiento promedio de 13,7±5,3 meses, ambos grupos (respondedores y no respondedores) mostraron un deterioro significativo en TFGe y un incremento en los niveles de creatinina sérica. La pérdida de función renal fue mayor en los no respondedores (−6,97 [p25: −1,92; p75: −4,8ml/min/mes) en comparación con los respondedores (−3,39 [p25: −0,3; p75: −2,2ml/min/mes; p<0,01).

En los pacientes respondedores, se observó una reducción estadísticamente significativa en la proteinuria, niveles de colesterol y un incremento en los niveles de albúmina sérica. Además, presentaron una reducción estadísticamente significativa en los niveles de CD25 soluble, numero de linfocitos CD3, CD3-IL2+ y ratio CD4/CD8. Por otro lado, presentaron un incremento significativo en CD8 DR+ y en el número de células T reguladoras. En los enfermos sin respuesta al tratamiento, se apreció una reducción significativa en los niveles de CD25 soluble, en los niveles de CD3 IL-2+, CD8DR+ y una reducción significativa en la ratio CD4/CD8, sin cambios en las demás variables (tabla 5).

La reducción en los niveles de CD25 soluble, fue significativamente superior en los enfermos que respondieron al tratamiento que en los que no respondieron (reducción media: −169,5±99,2 vs. −20,15±8,9pg/ml, respectivamente, p<0,01). Cuando se analizó la reducción de niveles de CD25 soluble según remisión parcial o total no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas.