NEFROLOGÍA. Vol. XXIV. Número 2. 2004 FORMACIÓN CONTINUADA Nuevos mecanismos moleculares de la nefrotoxicidad A. Ortiz, P. Justo, A. Sanz, B. Marrón 1 y C. Lorz Nefrología. Fundación Jiménez Díaz. Universidad Autónoma de Madrid e Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica. 1Actualmente en Baxter Healthcare. San Fernando. Madrid. El rasgo principal de la patología nefrotóxica es una disminución en el número de células titulares, que puede desarrollarse rápidamente y causar un síndrome de fracaso renal agudo, o progresivamente, asociándose a fibrosis renal y causando una insuficiencia renal crónica 1. La pérdida de células tubulares es también fundamental en la disfunción renal ocasionada por otras enfermedades. Así, el único parámetro histológico que se correlacioinó con la función renal en la necrosis tubular aguda fue la muerte de células tubulares 2. Por ota parte, existe una mejor correlación entre lesión tubulointersticial y función renal en las nefropatías crónicas de cualquier etiología, que entre lesión glomerular y función renal, incluso si la nefropatía es primariamente glomerular 3. Esto convierte a la célula del epitelio tubular renal en una célula clave de la insuficiencia renal. Publicaciones recientes sugieren que la muerte celular por apoptosis participa en la pérdida de células tubulares en la nefrotoxicidad y colabora también al fracaso renal agudo y a la insuficiencia renal crónica de otras etiologías (revisado en 4,5). Por ello, una mejor comprensión de los mecanismos que regulan la muerte de células tubulares puede facilitar el desarrollo de tratamientos para estas patologías, que, en la actualidad y, en general, carecen de un tratamiento patogénico específico. Nuestro grupo ha explorado los mecanismos moleculares de la muerte del epitelio tubular renal inducido por factores letales endógenos (como citoquinas letales) y exógenos, como las nefrotoxinas ciclosporina A (CsA) y paracetamol. Las citoCorrespondencia: Dr. D. Alberto Ortiz Unidad de Diálisis Fundación Jiménez Díaz Avda. Reyes Católicos, 2 28040 Madrid E-mail: aortiz@fjd.es quinas letales TNF, producida predominantemente por los macrófagos, y ligando de Fas (FaL), procedente sobre todo de los linfocitos T, inducen apoptosis de células tubulares renales 6, 7. Además, existen datos de interferencia con su función que indican su participación en la patogenia del fracaso renal agudo (revisado en 4, 8). Sin embargo, no hay estudios sobre la interrelación de estas citoquinas con las drogas nefrotóxicas. La CsA causa nefrotoxicidad aguda y crónica 9, 10. La nefrotoxicidad es el principal factor limitante de la dosis de la CsA y la elevada incidencia de insuficiencia renal crónica en pacientes receptores de injertos no renales es atribuible, en gran parte, al uso de anticalcineurínicos 10. La CsA es especialmente tóxica en pacientes con riñones previamente dañados. Así, prolonga el fracaso renal agudo postrasplante. Esto sugiere que el microambiente renal puede modificar la sensibilidad al efecto nefrotóxico. La sobredosis de paracetamol ocasiona fracaso renal agudo, con una afectación tubular de predominio proximal que puede tener manifestaciones de síndrome de Fanconi, y la ingesta crónica se ha asociado a insuficiencia renal crónica 11-14. De hecho, el Ad Hoc Committee de la National Kidney Foundation recomendó investigar sobre las bases biológicas de la nefrotoxicidad por paracetamol 15. Varios grupos han observado que la CsA induce apoptosis de células tubulares renales cultivadas 16, 17 e in vivo 18, 19. Aunque existe menos información sobre la base celular de la nefrotoxicidad del paracetamol, nuestro grupo ha observado que induce apoptosis en el epitelio tubular a concentraciones que son relevantes tanto para la terapéutica analgésica como para los intentos de autolisis 20. En este trabajo revisamos los resultados obtenidos en nuestro laboratorio en el transcurso de los estudios sobre los mecanismos moleculares de la apoptosis inducida por fármacos nefrotóxicos en células tubulares. 103 A. ORTIZ y cols. APOPTOSIS La apoptosis es una forma de muerte celular activa, que requiere un gasto de energía, la activación de mecanismos intracelulares letales y la inactivación de mecanismos intracelulares protectores (fig. 1) 4. El progreso en el conocimiento de la regulación molecular de la apoptosis ha sido rápido. Inicialmente se caracterizaron los mecanismos de la apoptosis mediada por activación de re- Citoquinas letales, v.g. FasL Stress celular Fas FADD Casp-8 Bid Bax Casp2 BclxL M Re Smac/Diablo Apaf1 Citocromo c Casp-9 IAP Caspasas efectoras Casp-3 y otras Casp-12 Factores antiapoptóticos Factores proapoptóticos Apoptosis Activación Inhibición Fig. 1.--Regulación molecular de la apoptosis. Diversos estímulos pueden inducir apoptosis. Las citoquinas letales se unen a receptores letales de la membrana celular y reclutan proteínas como FADD, que contribuyen a la activación de la caspasa-8. Esta, a su vez, activa caspasas efectoras (-3, -6, -7) que promueven la apoptosis, y también recluta la vía mitocondrial de la apoptosis a través de Bid. El stress celular puede dañar la mitocondria, mediante la translocación de Bax a la pared mitocondrial o mediante la activación de la caspasa-2. La lesión mitocondrial permite la liberación de citocromo c, que forma un complejo proteico en el citosol que facilita la activación de la caspasa-9. También se libera Smac/Diablo, que impide que las proteínas IAP (Inhibitor of apoptosis protein) eviten la activación de caspasas, amplificando así el daño. El stress celular puede dañar también el retículo endoplásmico, lo que conlleva la activación de la caspasa-12 y otros cambios. El esquema representa una célula. M: mitocondria. RE: retículo endoplásmico. 104 MECANISMOS MOLECULARES DE NEFROTOXICIDAD ceptores letales de la membrana celular, como Fas. En este caso, una citoquina legal (vg FasL) se une a un receptor de la membrana celular (vg Fas). Como resultado, se reclutan varias proteínas a un complejo proteico. Este complejo pone en marcha vías intracelulares de transducción de la señal letal, que incluyen, de forma fundamental, la activación de la caspasa-8 8. Posteriormente se demostró la participación de la mitocondria en la muerte celular causada por stress celular. En esta vía, proteínas letales como Bax dañan la mitocondria, y promueven la liberación de proteínas mitocondriales al citosol, donde estas activan la caspasa 9 21. Otras proteínas, como BclxL y Bcl2 contrarrestan el daño ocasionado por Bax 21. Existen otras vías de lesión mitocondrial, como la mediada por caspasa-2 22. Más recientemente se ha identificado el papel del retículo endoplásmico y se han caracterizado los mediadores intracelulares de la apoptosis causada por lesión nuclear 23, 24. La activación de la caspasa-12 es un evento precoz en el desencadenamiento de la apoptosis por lesión del retículo endoplásmico 23. Sea cual sea la vía de activación de la apoptosis, existe un componente final común, la activación de las caspasas efectoras -3, -6 y -7. Las caspasas son enzimas proteolíticas y las caspasas efectoras degradan proteínas protectoras y estructuras celulares. En la actualidad se continúa avanzando en el conocimiento de los mecanismos moleculares de la muerte celular, especialmente en los que confieren una especificidad de célula y de estímulo. reproduce el efecto protector de los factores de supervivencia del suero 6. Resulta interesante recordar que el epitelio tubular expresa FasL 7. Aunque originariamente se describió la expresión selectiva de esta citoquina en los linfocitos T y en tejidos con privilegio inmune, la realidad es que múltiples estirpes celulares la sintetizan. En algunas células FasL regula de forma autocrina la supervivencia. Esto no es así en el epitelio tubular sano 7. MECANISMOS MOLECULARES DE LA APOPTOSIS TUBULAR INDUCIDA POR FÁRMACOS NEFROTÓXICOS Conceptualmente los fármacos nefrotóxicos son agentes exógenos, que, en teoría, pueden desencadenar la muerte del epitelio tubular a través del reclutamiento de agentes letales endógenos, como citoquinas, o activando directamente vías intracelulares letales. Receptores letales Dado que el epitelio tubular es sensible a la apoptosis inducida por citoquinas letales, exploramos la hipótesis de que el sistema FasL/Fas estuviera involucrado en la apoptosis inducida por fármacos nefrotóxicos. En efecto, comprobamos como CsA y paracetamol aumentan la expresión del receptor letal Fas en la membrana celular tubular 20, 25. Este hecho habría sido interpretado en el pasado como muy sugestivo de un papel de Fas en nefrotoxicidad. Sin embargo, pudimos descartar la participación de receptores letales en la muerte celular inducida por nefrotóxicos en base a las siguientes observaciones de estudios funcion a l e s 20, 25: 1) La adición de FasL no incrementa la tasa de muerte en células expuestas a nefrotóxicos. 2) Los anticuerpos bloqueantes anti-FasL no previenen la muerte celular. 3) No se observa activación de caspasa-8. 4) Los inhibidores de la caspasa-8 no previenen la muerte celular. Es preciso depurar las razones por las que un incremento en la expresión de Fas aumenta la letalidad de este receptor cuando el estímulo es un cóctel de citoquinas, pero no cuando el estímulo es un fármaco nefrotóxico. Es posible que las nefrotoxinas tengan acciones adicionales. Por ejemplo, la CsA disminuye la expresión de FADD, una proteína necesaria para la transmisión de la señal intracelular letal 105 MECANISMOS MOLECULARES DE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR CITOQUINAS LETALES Las citoquinas letales FasL y TNF inducen apoptosis de células tubulares 6, 7. El número de receptores letales en la superficie celular es uno de los mecanismos que regulan la sensibilidad celular a la apoptosis por FasL. Así, el pretratamiento del epitelio tubular con un cóctel de citoquinas aumenta la expresión del receptor Fas en la superficie celular y la apoptosis inducida por FasL 7. Diversos factores de supervivencia protegen de esta forma de muerte celular. El mecanismo del efecto protector es, al menos, doble. Por una parte de los factores de supervivencia disminuyen la expresión de Fas 7. Por otra parte, estos factores aumenta la expresión de la proteína protectora intracelular BclxL 6. De hecho, la sobreexpresión dirigida por un transgen de BclxL A. ORTIZ y cols. desde Fas 25. Alternativamente, las citoquinas pueden tener otras acciones, como aumentar la expresión de la proteína letal mitocondrial Smac/Diablo 26. Lesión mitocondrial A continuación evaluamos la participación de la vía mitocondrial de la apoptosis en nefrotoxicidad. Los hallazgos implican a esta vía de forma decisiva en la apoptosis tubular mediada por CsA, pero no en la mediada por paracetamol 20, 25. En concreto: 1) La CsA, pero no el paracetamol, activa la caspasa-2, y los inhibidores de esta caspasa evitan la lesión mitocondrial y la apoptosis por CsA. Esta es la primera observación que implica a la caspasa-2 en patología renal. Sin embargo, los inhibidores de la caspasa-2 no protegen frente a paracetamol. 2) La CsA, pero no el paracetamol, induce la translocación de Bax desde el citosol a la mitocondria, y los oligodeoxinucleótidos antisetido anti-Bax evitan la apoptosis por CsA, pero no por paracetamol (fig. 2a). 3) La CsA, pero no el paracetamol, depolariza la mitocondria e induce liberación de citocromo c y Smac/Diablo al citosol. Estos datos confirman y amplían la observación de que CsA produce daño mitocondrial de forma selectiva en el epitelio tubular 17. Lesión del retículo endoplásmico La liberación mitocondrial de citrocromo c y Smac/Diablo explica como puede la CsA activar las caspasas 9 y 3. Es más, el hecho de que los inhibidores de estas caspasas eviten la apoptosis inducida por CsA implica que su activación es un hecho funcionalmente importante 25. Sin embargo, ambas caspasas también se activan durante la apoptosis tubular inducida por paracetamol20. Además, los inhibidores de las caspasas 9 y 3 no protegen frente a la apoptosis por paracetamol, sugiriendo que estas no son funcionalmente importantes en esta forma de muerte 20. Esto indica que existe una vía alternativa de activación de las caspasas en el caso del paracetamol (no a través de receptores letales ni de la lesión mitocondrial). Observamos evidencia de lesión de retículo endoplásmico tanto por CsA como por paracetamol (aumenta la expresión y activación del factor de transcripción GADD153), pero únicamente el paracetamol activa la caspasa-12, ca106 racterística de la vía del retículo endoplásmico (fig. 2b) 20, 25. Aún siendo característica, la acticación de caspasa-12 no es la única vía letal intracelular activada cuando se daña el retículo endoplásmico. De hecho, un pan-inhibidor de caspasas evitó la morfología apoptótica pero no la muerte celular 20, lo que sugiere que el paracetamol activa simultáneamente varias vías letales intracelulares. BclxL: una proteína con un amplio espectro protector Las dos nefrotoxinas disminuyen la expresión del factor protector BclxL. Este es un efecto sobre la degradación de la proteína, que, en el caso del paracetamol, está mediado, al menos en parte, por el proteasoma 27. Resulta interesante comprobar que la sobreexpresión de BclxL protegió frente a la letalidad inducida por los dos estímulos 27. Es posible que la acción protectora de BclxL tenga lugar a distintos niveles, según el estímulo. Así, BclxL impediría la lesión mitocondrial en la apoptosis mediada por receptores y por stress mitocondrial pero también tendría una acción protectora sobre el retículo endoplásmico 28 (fig. 1). POSIBLES IMPLICACIONES TERAPÉUTICAS En resumen, los estudios aquí presentados objetivan la existencia de diversas vías de lesión letal de las células tubulares, activadas por estímulos endógenos, como citoquinas, y exógenos, como nefrotoxinas. Es más, estos estudios apoyan el concepto de que las vías intracelulares inductoras de apoptosis son específicas de estímulo (fig. 3). Como consecuencia, determinadas estrategias terapéuticas protegen de forma específica frente a ciertos estímulos. Así, la inhibición de Bax o de caspasas protege frente a la apoptosis inducida por CsA, pero no por paracetamol 20, 25. Existen dos implicaciones terapéuticas directas: 1) La especificidad de estímulo permitirá manipular de forma selectiva la muerte celular tubular ocasionada por ese estímulo. La ventaja de esta aproximación está en evitar modificar, de forma indeseada, la muerte celular fisiológica. Estos tratamientos podrían ensayarse en la profilaxis selectiva de la nefrotoxicidad por estímulos concretos, reconocidamente nefrotóxicos. 2) Como contrapartida, resulta más difícil encontrar un protector universal de la muerte del epitelio tubular, eficaz ante una gran variedad de agresiones. Nuestros estudios sugieren que los MECANISMOS MOLECULARES DE NEFROTOXICIDAD A 120 Control 100 % Supervivencia 80 60 40 20 0 ODN Bax antisentido ODN Bax control CsA Pt Control CsA B GADD 153 Procaspasa-12 Caspasa-12 Tubulina Fig. 2.--Proteínas relacionadas con la lesión de la mitocondria y el retículo endoplásmico en la muerte celular tubular por nefrotoxinas. A) La apoptosis mediada por CsA requiere de la participación de Bax. La disminución de los niveles de Bax, lograda mediante oligodeoxinucleótidos (ODN) antisentido, protege frente a la apoptosis inducida por CsA, pero no por paracetamol (Pt). ODN Bax control es un ODN con la misma composición de bases que el antisentido, pero desordenadas. *p < 0,05 vs CsA. B) La apoptosis mediada por paracetamol se caracteriza por datos de lesión del retículo endoplásmico, con aumento de la expresión del factor de transcripción GADD153 y, sobre todo, activación de la procaspasa 12, evidenciada por proteolisis, con generación de fragmentos activos (caspasa-12). Las células control fueron incubadas con el vehículo de las nefrotoxinas. Estudios realizados tras 24 h de incubación con paracetamol 300 microgramos/m o CsA 10 microgramos/ml. Pt 107 A. ORTIZ y cols. A CsA Receptores letales Bax ODN Translocación Bax y lesión mitocondrial Lesión RE?? Fas No activación casp8 GADD153 Liberación de citocromo c No activación casp12 Inhibidor de casp Activación casp9 y casp3 Apoptosis B Paracetamol Receptores letales No lesión Bax, no lesión mitocondria Lesión RE Fas No activación casp8 GADD153 Inhibidor de casp Activación casp12 Inhibidor de casp Activación casp9 y casp3 Mediadores? Apoptosis Muerte celular no apoptótica? Fig. 3.--Esquema resumen. A) Mecanismos moleculares de la nefrotoxicidad por CsA. B) Mecanismos moleculares de la nefrotoxicidad por paracetamol. 108 MECANISMOS MOLECULARES DE NEFROTOXICIDAD tratamientos que aumenten la expresión de BclxL pueden ser protectores de amplio espectro. Esto podría ser una ventaja, por resultar potencialmente útiles frente a un mayor número de estímulos perjudiciales, pero también un problema, por su mayor capacidad para interferir con la muerte celular fisiológica. Así, por ejemplo, la sobreexpresión de BclxL antagoniza el efecto letal de los inhibidores de la HMGCoA reductasa sobre el epitelio tubular proliferante 29. Este efecto de las estatinas podría explicar la protección que ofrecen frente al desarrollo de carcinoma r e n a l 30. AGRADECIMIENTOS Los trabajos citados de los autores publicados entre 2001 y 2003 fueron financiados con una ayuda a la investigación de la Sociedad Española de Nefrología. BIBLIOGRAFÍA 1. Cronin RE, Henrich WL: Toxic nephropathy. En: Brenner BM (ed). 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