NEFROLOGIA. Val. XIV. Núm. 4. 1994 La bomba de sodio: una familia multigénica P. Martín Vasallo *, L. M. González Martínez *, C. Y. Rodríguez Díaz*, E. Gallego ** y J. J. García Pérez ** * Laboratorio de Biología del Desarrollo. Departamento de Bioquímica y Biología Molocular. Universidad de La Laguna Tenerife. ª Sección de Nefrología Hospital Ntra. Sra. de la Candelaria. Tenerife. Cuando hablamos de una familia génica nos referimos a un determinado número de genes que codifican proteínas con la característica común de poseer homología entre elementos funcionales comunes, como por ejemplo sitios de fijación de ligandos como glucosa, ATP, fosfato inorgánico, iones o substratos en general. Si se trata de isoenrimas, la homología estructural puede ser desde el 80% hasta más del 99%. Estos discretos cambios estructurales durante la evolución han dado lugar a modificaciones funcionales muy sutiles. Esto son los isoenzimas o isoform a s . Las isoformas, aun desarrollando la misma función, tienen una distribución particular según los tejidos o grupos celulares, lo que contribuye a otorgar propiedades especializadas a éstos. En esta revisión describiremos las particularidades de cada uno de los miembros de la (Na,K)-ATPasa o bomba de sodio, que ha demostrado ser una familia multigénica, integrada por, al menos, cinco genes y cuyos productos asociados como protómeros alfabeta forman sistemas activos de transporte en la membrana plasmática. El esquema que aparece en la figura 1 sirve de guión de la vida de una proteína, desde el gen que la codifica hasta la forma madura funcionalmente activa. En el mismo esquema se indican las sondas con las que explorar cada uno de los pasos de su biología. Basados en él comentaremos los datos mas relevantes en la actualidad de la biología de la (Na, K)-ATPasa La (Na,K)-ATPasa es un enzima de la membrana plásmatica de las células de mamifero. Y allí donde se ha descrito se ha presentado siempre el cliché común de un oligómero funcionante formado por la asociación de una subunidad alfa y una subunidad beta 1. La subunidad alfa, un polipéptido de unos 10. GDNA 9 CONA RNTICUERPO ANTICUERPO FUNCIONES LIGRNOOS MRRCROOS Correspondencia: Dr. Pablo Martín Vasallo. Laboratorio de Biología del Desarrollo. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de La Laguna. Carretera Vieja de la Esperanza, s/n. La Laguna 38206 Tenerife. 100 kDa (fig. 2) de peso molecular, está implicada en los procesos de trasvase de iones sodio, potasio, magnesio, calcio 2 y protones 3 así como de la fijación de ATP y fosfato inorgánico. Además de las funciones implicadas en la «bomba de sodioa, la subu n i d a d alfa es el receptor de los glicósidos cardiotónicos 4. La subunidad beta es un polipéptido glicosilado con un peso molecular de unos 55 kDa (fig. 2), que, aun siendo indispensable para el funcionamiento de la subunidad alfa, no parece estar implicada directamente en la actividad «bomba de so427 P. MARTIN VASALLO Y COLS $1 621 AY00 1 . 1 cies animales fue clonada algunas semanas más tarde. Al año siguiente, sus homónimas humanas y las de otras especies del reino animal 6-12. Una vez secuenciados los cDNAs de cualquier proteína se deduce su secuencia peptídica, y a partir de estos datos se predicen sus estructuras secundaria y terciaria, calculando las posibilidades que tienen determinadas zonas de incluirse en la membrana. De esta forma se ha elaborado el modelo de subunidad alfa como una proteína que contiene siete segmentos de estructura en hélice alfa que constituyen los siete dominios incluidos en la membrana plasmática (HIH7) y ocho extracelulares. El lugar de fijación de glicósidos se encuentra en el dominio extracelular situado entre los dominios HI y H2; es por ello que este dominio es el más variable entre isoformas y entre especies de distinta sensibilidad a los glIósidos. la subunidad beta se ancla a la membrana con un solo dominio y en todas las especies en que se ha descrito se han encontrado conservados tres residuos de asparragina, adonde se unen las cadenas de polisacáridos que la caracterizan. Estos datos ya fueron re13, donde se visados en Nefrología 1:7-15, 1989 incluye una figura con la estructura de ambas subunidades. Fig. 2.- Inmunoblot que muestra los tamaños de cada una de las distintas isoformas de la (Na, K)-ATPasa. Los microsomas fueron obtenidos de epitelio ciliar de ojo y sondado con anticuerpos antialfa- 7 (15), anti-alfa-2 (1), anti-alfa-3 (52), anti-beta- 7 (48), antibeta-2 (20). Estos resultados son parte de los publicados en la figura 3 de la referencia 47. La bomba de sodio se transforma en una familia multigénica La tecnología del DNA recombinante puso en evidencia a finales de 1986 la existencia de tres cDNAs con secuencias diferentes que codifican tres subunidades alfa diferentes en la misma especie animal, la rata 14. Durante los años siguientes también se han clonado los correspondientes a éstos en las distintas especies, entre ellas la humana 15. En todos los casos estos cDNAs son producto de tres genes distintos, no obtenidos mediante un fenómeno de splicing alternativo del mismo gen. Estas tres subunidades alfa, que difieren en estructura primaria, son las denominadas isoformas alfa-1, alfa-2 y alfa-3. Los genes que las codifican presentan unos patrones de expresión diferencial que varían según los tejidos, los grupos celulares dentro del mismo tejido y según las distintas etapas del desarrollo. Las señales precisas y específicas por las que cada célula o tejido expresa una isoforma y no otra son apenas conocidas en algunos casos. Las funciones específicas de cada isoforma empiezan a Conocerse ahora. Además habría que añadir, a las incógnitas anteriores, la de las posibilidades de asociación de subunidades, es decir, asociaciones alfa-1 c o n beta-1, 2 ó 3, alfa-2 con beta-1, 2 ó 3 y alfa-3 con beta-1, 2 ó 3. dio» como tal, pero sí con el ensamblaje del sistema en la membrana. La variación en la sensibilidad a los glicósidos cardíacos que se presenta entre los tejidos de la misma especie ya hizo sospechar la existencia de formas distintas de la misma proteína. Para confirmarlo se purificó (Na,K)-ATPasa de distintos tejidos y se generaron anticuerpos contra ellas, observándose que los anticuerpos generados contra la (Na,K)-ATPasa de un tejido inhiben la de los otros con una menor eficacia que la del tejido que se usó como antígeno 1. La historia escrita de fa Biología molecular de la bomba de sodio comienza en el verano de 1985 con la publicación en Nature de dos artículos en los que se describen clones de cDNA que contienen la pauta de lectura completa que codifica la subunidad alfa de riñón de oveja 5 y la de la electroplaca del pez Torpedo califórnica 6, poco más tarde la humana 7. La subunidad catalítica de la (Na,K)-ATPasa había sido clonada. La beta de los mismos tejidos y espe428 BOMBA DE SODIO Los mensajes Una vez obtenidos los cDNAs se procedió a su utilización como sondas en northern blots que se elaboraron a partir de RNAs obtenidos de órganos de anim a l e s (incluida la especie humana) en distintas etapas del desarrollo. De este modo es posible determinar qué tejidos expresan los genes y como se regula el nivel de expresión en los estadios de la vida. Los lavados se realizaron siempre en las condiciones más severas: alta temperatura (65 ºC), baja fuerza iónica (NaCI 15 mM, sodio citrato 1,3 mM, potasio monofosfato 1,3 mM y EDTA 0,1 mM ) y detergente (SDS al 0,1 %) durante al menos dos horas. Utilizando como referencias los RNA ribosómicos (rRNA) 18s (1,9 kb) y 28s (4,7 kb) se determinaron los tamaños de los mRNA de cada una de las isoformas de las dos subunidades. La figura 3 ilustra cómo en todos aquellos tejidos en los que se expresa el gen de la isoforma alfa-l lo hace con una sola especie de mRNA cuyo tamaño en la especie humana es de unas 4,5 kb 16. La isoforma alfa-2 presenta dos especies de mRNA, una de aproximadamente 4,3 y otra de 6,0 kb 16. El gen de la isoforma alfa-3 se expresa mediante un mRNA de 4,5 L Fig. 4.-Northern blot de tejidos de rata. Se observan las distintas e s p e c i e s de mRNA de las dos isoformas conocidas de la subunidad beta de la (Na, K)-ATPasa, la intensidad con que éstas se expresan en diversos tejidos y en tres etapas del desarrollo: neonatal (2 días) (panel A), joven (2 semanas) (panel B) y adulta (2 m e s e s ) (panel C). 28s y 18s señalan los dos tipos de RNA ribosómico que han servido como marcadores para establecer el tamaño de los transcritos. kb 16 . Expresión diferencial de los isoenzimas En las figuras 3, 4 y 5 se pueden observar los niveles de expresión en distintos tejidos y períodos del desarrollo de cada uno de los miembros de la familia génica que nos ocupa. Comentaremos algunos tejidos en particular 16,17. Cerebro Los RNA mensajeros de las tres isoformas de la subunidad alfa se expresan en el cerebro de los vertebrados adultos. Mediante el uso de anticuerpos monoespecíficos se han localizado las proteínas y se han establecido los patrones de distribución en los distintos órganos, grupos celulares y regiones subcelulares del sistema nervioso. Sus detalles están fuera del ánimo de esta revisión. Es interesante conocer que la alfa-1 de cerebro es inmunológicamente indistinguible de la de riñón y la alfa-2 de cerebro idéntica a la de músculo esquelético; sin embargo la alfa-3 hasta el momento sólo se ha encontrado en cerebro. Los cambios en la expresión de las subunidades alfa durante el desarrollo embrionario han sido bien estudiados en la rata: el embrión expresa solamente hasta el 13-14 día la isoforma alfa-1, según los márgenes de resolución actual. El próximo gen en expresarse es el de la alfa-2, hacia el día 18, y su gradiente de incremento en la expresión está claramente relacionado con el proceso de mielinización. La alfa-3 aparece por la misma fecha y su máxima proporción con respecto a las otras dos se alcanza hacia el 21 día fetal. 429 HIGMXI - J ff! 2850 18s. 1 28s. 1880 YO PS as a.1 a% . Fig. 3.-Northern blot de tejidos de rata. Se observan las distintas especies de mRNA de cada una de las isoformas de la subunidad alfa, la intensidad con que éstas se expresan en diversos tejidos y en tres etapas del desarrollo: fetal, neonatal y adulta. 28s y 18s señalan los dos tipos de RNA ribosómico que han servido como marcadores para establecer el tamaño de los transcritos. La figura 4 muestra cómo el gen de la isoforma beta-1, dependiendo del tejido y de la etapa del desarrollo, se expresa mediante varias especies de mRNA cuyo tamaño oscila entre 1,9 y 3,0 kb, en tanto que el de la beta-2 sólo presenta un mRNA de 3,4 kb 17. P. MARTIN VASALLO Y COLS Corazón El primer indicio de la existencia de dos formas distintas de (Na,K)-ATPasa en el corazón llegó con el conocimiento de las respuestas inotrópicas bifásicas a los efectos de los digitálicos. Confirmando estos datos, los análisis de expresión génica mediante northern blots indican que en el corazón adulto existen dos isoformas: la alfa-1 y la alfa-2, es decir, la forma más insensible a los glicósidos y la identificada como el receptor de las drogas digitálicas. En el corazón de feto de rata se encuentran las tres isoformas; la expresión de la alfa-3 decrece después del nacimiento hasta desaparecer por completo en el adulto. Riñón Los estudios de fijación de ouabaína, cinética enzimática y análisis inmunológicos en las distintas regiones renales han proporcionado unos mapas claros de distribución de actividades de (Na,K)-ATPasa a lo largo de la nefrona; sin embargo, aún faltan estudios de identificación de isoformas en grupos celulares determinados y su correlación con el tipo de función realizada por éstas, así como de las posibles regulaciones a que pudiera estar sometida cada isoforma en particular. Como puede verse en las figuras 3 y 5, las isoformas alfa-1 y alfa-2 se expresan en el riñón del feto; rápidamente después del nacimiento se expresan las tres isoformas para permanecer de la misma forma durante toda la vida del adulto normal. Hígado En el hígado del neonato y en el del adulto se expresan las tres isoformas de la subunidad alfa; no así en el del feto, que sólo se expresa la alfa-1. Sin embargo, existe una gran discrepancia respecto a los tipos de células en particular. Isoformas de la subunidad beta, su estructura y expresion diferencial En 1986 se publican la secuencia del cDNA que codifica la llamada subunidad beta de la (Na,K)ATPasa, su estructura primaria y su expresión diferencial en tejidos de rata y en líneas celulares derivadas del sistema nervioso central de la misma especie 8, 11. El análisis de los transcritos muestra distintos niveles de expresión en todos los tejidos estudiados, exceptuando el hígado, que al parecer carece de subunidad beta, extremo éste confirmado por los experimentos inmunohistoquímicos del grupo de Leffert 18. Sin embargo, la bomba de sodio para funcionar necesita la subunidad beta en relación equimolecular con la subunidad alfa, y en el hígado se encuentran niveles intermedios de la isoforma alfa-1. Así pues, debería existir otra proteína congénere de la subunidad beta y con una función similar en lo que su colaboración en el sistema de transporte se refiere. Usando como sonda el cDNA de la subunidad beta-l de rata, en condiciones de baja astringencia, Martín Vasallo y cols. llevan a cabo el muestreo de una genoteca complementaria de hígado de feto humano y de cerebro de rata, aislándose clones que codifican una isoforma de la subunidad beta de la (Na,K)-ATPasa 17. La comparación de las secuencias aminoacídicas deducidas de los cDNAs humano y de rata con todas las secuencias almacenadas en el banco de datos de la National Biomedical Research Foundation mostró sólo similitud con las secuencias conocidas de la subunidad beta de la (Na,K)-ATPasa de las distintas especies animales. Por ello al polipéptido producto de este cDNA se le denominó beta-2 y los previamente caracterizados beta-1. Esta isoforma beta-2 está constituida por 290 aminoácidos, 13 menos que la beta-1; posee también un solo dominio intramembrana y presenta siete puntos de glicosilación 17. 430 BOMBA DE SODIO El análisis de la expresión de los mRNAs de la subunidad beta se llevó a cabo con sondas específicas para las suhunidades beta-1 y beta-2, hibridando secuencialmente blots que contenían RNA de tejidos de rata en tres estadios del desarrollo: dos días, dos semanas y ratas adultas (fig. 4). En la rata neonata (2 días), los transcritos de beta-2 son más abundantes en cerebro, mientras que la beta-l es más ahundante en riñón. En el hígado del neonato sólo se encuentran trancritos de beta-2; la beta-1 no se expresa. A las dos semanas la beta-l sigue siendo la forma preponderante en riñón y la beta-2 en cerebro con niveles moderados de beta-1 que también se expresa dentro del mismo rango en co razón y glándulas suprarrenales y en el hígado en hajos niveles, En los tejidos del adulto, la beta-2 continúa siendo la forma predominantemente cerebral y la beta1 predominantemente renal; las relaciones de los niveles en otros órganos están sujetas a variaciones no muy llamativas, a excepción del hígado, en el que no se aprecia expresión ni de beta-1 ni de beta-2. Estos patrones de expresión tan distintos entre isoformas sugieren que las diferentes formas de la subunidad beta pueden desempeñar roles especializados en los diferentes tejidos. Aún no se ha encontrado una isoforma beta en el hígado adulto. Se han llevado a cabo varios sondeos y por distintos métodos, todos ellos sin éxito. Se ha descrito una subunidad beta-3 en Xenopus 19 ;se trata de un péptido estructuralmente similar a los anteriores, pero con una secuencia primaria lo suficientemente distinta para confirmar que no se trata de ninguno de los conocidos; por ello sus autores la han denominado beta-3; sin embargo, no se ha encontrado su correspondiente en mamífero, a quien realmente debería denominarse beta-3. dad beta del mismo sistema 21 El anticuerpo monoclonal que bloquea la adhesión célula-célula también estimula un 30% la captación de 86Rb, un 30% de astrocitos en cultivo. El mecanismo por el cual un anticuerpo que bloquea la subunidad beta de la (Na,K)ATPasa estimula la actividad de la bomba es todavía desconocido, pero, al menos, demuestra que este anticuerpo interacciona con la (Na,K)-ATPasa activa 21 En definitiva, parece ser que la beta-2 juega un papel doble: como una suhunidad de la (Na,K)-ATPasa, asociada a la alfa-2, y como un componente de la interacción célula-célula 20. La secuencia de la beta-2 no es homóloga a la de otras proteínas de adhesión conacidas, aunque la aislada de ratón tiene el epítope carbohidrato L3, común con otras proteínas de adhesión. De la proteína que actúa como receptor de beta2/AMOG aún no se conoce nada. Estudios de la estructura génica y asignación cromosómica Para aislar el gen de cualquier proteína se muestrea una genoteca genómica utilizando como sonda el cDNA correspondiente (fig. 1) o un oligonucleótido sintético con la misma estructura que parte del extremo 5'-UT de este cDNA. Se secuencia y la comparación de la secuencia del gen con la de su cDNA correspondiente nos revelará los intrones y exones que lo componen, así como, en el caso de familias de proteínas, si proceden de varios genes, como es el caso de la (Na,K)-ATPasa o del splicing alternativo de intrones o determinadas secuencias intermedias de un solo gen, como en el caso de los más de noventa isoenzimas que forman la familia de las mi»sinas. Junto con las denominadas secuencias consensus que son comunes en la regulación de la expresión de muchos genes, tales como cajas TATA y CAAT y potenciales sitios de fijación para hormonas y factores implicados en los mecanismos de transcripción, deben delimitarse secuencias como la del promotor 0 promotores y otros elementos responsables de la especificidad de expresión tisular. Este tipo de investigación constituye uno de los campos más atractivos de la Biología molecular actual, y así resulta apasionante la elección de un tipo de células o líneas celulares que expresen un determinado gen y otro tipo que lo reprima para, utilizando un gen <