La albuminuria es un indicador de daño orgánico subclínico y un marcador de riesgo cardiovascular y de enfermedad renal. Un porcentaje de pacientes hipertensos desarrollan albuminuria a pesar de estar bajo supresión crónica del sistema renina-angiotensina (SRA). Previamente identificamos metabolitos en orina asociados al desarrollo de albuminuria. En este estudio, investigamos alteraciones metabólicas que reflejen distintos niveles dentro de la condición de normoalbuminuria.
Pacientes, materiales y métodosSe analizó la orina de 48 pacientes hipertensos con supresión crónica del SRA. Se clasificaron según el cociente albúmina/creatinina (ACR) en 3 grupos: normoalbuminuria (<10mg/g); normal-alta (10-30mg/g en varones, o 20-40mg/g en mujeres) y albuminuria moderadamente elevada (microalbuminuria: 30-200mg/g o 40-300mg/g, respectivamente). El metaboloma se analizó mediante espectrometría de masas y se realizó un análisis de correlaciones entre los niveles de los metabolitos alterados y ACR.
ResultadosOxalacetato, 3-ureidopropionato, guanidoacetato y malato muestran una variación significativa entre los grupos normo y micro. Además, estos metabolitos son capaces de diferenciar entre los pacientes normo y normal-alta. Igualmente se observó correlación significativa entre el nivel de los metabolitos identificados con el nivel de ACR. Las variaciones observadas señalan una alteración del metabolismo energético ya en pacientes con albuminuria en el rango normal-alta.
ConclusionesSe confirma la asociación del panel molecular constituido por 3-ureidopropionato, oxalacetato, malato y guanidoacetato con distintos niveles de albuminuria. Así mismo, se ha identificado una huella metabólica capaz de mostrar variación dentro de la condición de normoalbuminuria, lo que permite una estratificación molecular más temprana de los pacientes.
Albuminuria is an indicator of sub-clinical organ damage and a marker of cardiovascular risk and renal disease. A percentage of hypertensive patients develop albuminuria despite being under chronic suppression of the renin-angiotensin system (RAS). We previously identified urinary metabolites associated with the development of albuminuria. In this study, we searched for metabolic alterations which reflect different levels within the condition of normoalbuminuria.
Patients, materials and methodsUrine from 48 hypertensive patients under chronic RAS suppression was analysed. They were classified according to the albumin/creatinine ratio (ACR) into 3groups: Normoalbuminuria (<10mg/g); high-normal (10-30mg/g in men, or 20-40mg/g in women); and moderately high albuminuria (microalbuminuria, 30-200mg/g or 40-300mg/g, respectively). The metabolome was analysed by mass spectrometry and a correlation analysis was performed between altered metabolite levels and ACR.
ResultsOxaloacetate, 3-ureidopropionate, guanidoacetate and malate show significant variation between the normo and micro groups. Additionally, these metabolites are able to differentiate between patients in the normo and high-normal range. A significant correlation between metabolites and ACR was found. Observed variations point to alterations in the energy metabolism already in patients with albuminuria in the high-normal range.
ConclusionsThe association between the molecular panel consisting of 3-ureidopropionate, oxaloacetate, malate and guanidoacetate and different levels of albuminuria is confirmed. A metabolic fingerprint was also identified showing variations within the condition of normoalbuminuria allowing an earlier molecular stratification of patients.
La hipertensión es una de las enfermedades con mayor prevalencia en todo el mundo1. En torno a un 30-40% de la población adulta mundial es hipertensa. Uno de los tratamientos de primera línea para su control es la inhibición crónica del sistema renina angiotensina (SRA) mediante monoterapia o en terapia combinada con otros antihipertensivos, con demostrada eficacia en la reducción de la presión arterial. Sin embargo, un destacable porcentaje de pacientes hipertensos controlados desarrollan albuminuria (16,1% en seguimiento a 3 años)2. La albuminuria es la expresión clínica de un proceso fisiopatológico multifactorial y complejo que lleva asociado un incremento del riesgo cardiovascular3,4. Si bien solo la presencia de albuminuria puede no ser predictiva de progresión de enfermedad renal crónica5, sí existen evidencias de una asociación entre cambios en los niveles de albuminuria y el desarrollo o agravamiento de la enfermedad renal6-8.
La albuminuria es un indicador de daño orgánico subclínico. Su desarrollo tiene lugar de forma continuada y como tal deben considerarse sus consecuencias sobre el riesgo cardiovascular y el daño renal9. Estudios previos muestran como la asociación entre el desarrollo de albuminuria y la existencia de eventos cardiovasculares empieza a niveles de ACR dentro del rango de normoalbuminuria tan bajos como 4,4mg/g10; 6,6mg/g11 o, en cualquier caso, <10mg/g12. Particularmente, el riesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular en diabéticos aumenta en un factor de 10 si la albuminuria aumenta de 10 a 30mg/d13 y, en la población general, un aumento en 5-10mg/L se asocia a un 29% más de riesgo de mortalidad por enfermedad cardiovascular14. De la misma forma, predice el desarrollo de hipertensión en el rango normal-alto (<30mg/g)15 y de la enfermedad renal crónica en no diabéticos7,8.
La mayor dificultad en estrategias de prevención es que no es posible anticiparse a conocer qué sujetos desarrollarán albuminuria. Una de las principales razones es que los mecanismos moleculares que subyacen no se conocen en su totalidad. El valor de la orina en el estudio de la enfermedad cardiovascular ha sido ampliamente demostrado16-19. En concreto, en estudios previos identificamos marcadores moleculares en orina asociados a la condición de albuminuria que apuntan a alteraciones en la respuesta inmunitaria, sistema de coagulación, respuesta inflamatoria, remodelado vascular y estrés oxidativo como los principales procesos biológicos implicados20-22. En este trabajo exploramos la existencia de un perfil metabolómico diferencial en sujetos clasificados según su nivel de ACR en: a) <10 mg/g (normo); b) 10-30 mg/g en varones o 20-40 mg/g en mujeres (normal-alta); c) 30-200 mg/g o 40-300mg/g, respectivamente (micro). De este modo se diferencia entre individuos que no se espera que desarrollen albuminuria (normo) y aquellos que sí son susceptibles de desarrollarla (normal-alta). Analizamos la huella metabólica previamente identificada para investigar si existe variación metabólica asociada a una condición de albuminuria temprana o incipiente con la finalidad de estratificar el riesgo cardiorrenal a nivel molecular y así adaptar mejor la estrategia terapéutica en estos pacientes.
Material y métodosSelección de pacientesEn la Unidad de Hipertensión del Hospital 12 de Octubre de Madrid se seleccionó a un total de 48 pacientes hipertensos controlados bajo supresión crónica del SRA durante un mínimo de 2años. Aquellos pacientes con hipertensión arterial secundaria fueron excluidos del estudio. Se incluyó a pacientes con diabetes mellitus y sin ella de entre 45 y 70 años. El estudio se realizó según las recomendaciones de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital 12 de Octubre, previo consentimiento informado de los pacientes.
Los sujetos se clasificaron según el valor de ACR en 3 grupos: normo (N), los individuos con ACR < 10 mg/g, de los que, según el estudio ROADMAP, se sabe que no desarrollarán albuminuria23; normal-alta (NA), los individuos con ACR = 10-30 mg/g (varones) o 20-40 mg/g (mujeres) y microalbuminuria (M), los individuos con ACR = 30-200 mg/g o 40-300mg/g, respectivamente. Las guías clínicas emplean como criterio de clasificación general un punto de corte de ACR = 30mg/g entre albuminuria y albuminuria moderadamente elevada24. En el caso de las mujeres, el punto de corte se ha aumentado ligeramente a 40mg/g25, considerando que la liberación de creatinina en orina se ve influida por la masa muscular. La tabla 1 recoge las características clínicas de los sujetos incluidos en el estudio.
Características clínicas de los pacientes incluidos en el estudio
| Normo (n = 22) | Normal-alta (n = 17) | Microalbuminuria (n = 9) | |
|---|---|---|---|
| Edad (años) | 57 ± 9 | 64 ± 5 | 65 ± 3 |
| Sexo (% masculino) | 59 | 76 | 66 |
| Colesterol (mg/dl) | 179 ± 38 | 166 ± 29 | 154 ± 29 |
| Triglicéridos (mg/dl) | 110 ± 33 | 125 ± 59 | 122 ± 32 |
| Colesterol HDL (mg/dl) | 54 ± 16 | 53 ± 16 | 50 ± 7 |
| Colesterol LDL (mg/dl) | 102 ± 31 | 88 ± 30 | 91 ± 26 |
| Ácido úrico(mg/dl) | 5 ± 1 | 6 ± 2 | 7 ± 2 |
| eGFR (ml/min/1,73 m2) | 86 ± 16 | 85 ± 20 | 93 ± 22 |
| ACR (mg/g) | 4 (3-6) | 22 (18-31) | 85 (44-99) |
| Diabetes mellitus tipo II (%) | 18 | 24 | 67 |
| PAS (mmHg) | 140 ± 14 | 144±14 | 141 ± 19 |
| PAD (mmHg) | 85±8 | 83±8 | 79 ± 5 |
| Tratamiento antihipertensivo (%) | |||
|---|---|---|---|
| IECA | 18 | 18 | 67 |
| ARA | 41 | 65 | 33 |
| Diuréticos | 45 | 47 | 22 |
| α-bloqueantes | 18 | 0 | 22 |
| β-bloqueantes | 32 | 29 | 33 |
| Bloqueantes del canal de calcio | 41 | 71 | 78 |
ACR se expresa como mediana (rango intercuartílico). El resto de las variables se expresan como frecuencias o como media ± desviación estándar.
ACR: cociente albúmina/creatinina; ARA: antagonista de los receptores de angiotensina; eGFR: filtrado glomerular estimado; IECA: inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina; PAD: presión arterial diastólica; PAS: presión arterial sistólica.
Se recogió la primera orina de la mañana, se centrifugó para eliminar restos celulares y se almacenó a −80°C hasta su análisis. El análisis cuantitativo de los metabolitos se realizó mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas dirigida en modo selected reaction monitoring (SRM-LC-MS/MS). Esta metodología fue seleccionada como método del año por la revista Nature Methods 201226. Con base en estudios previos de nuestro laboratorio, se extrajeron los metabolitos de la orina tras la eliminación de la fracción proteica por precipitación orgánica27,28. El sobrenadante se filtró y se analizó en un espectrómetro de masas Triple Cuadrupolo QQQ6460 (Agilent Technologies) acoplado a un sistema binario de cromatografía líquida (1200 series, Agilent Technologies) controlado por el programa Mass Hunter (v4.0 Agilent Technologies).
Análisis estadísticoLa señal correspondiente a cada metabolito se integró mediante el programa Mass Hunter Adquisition Data Qualitative Analysis B.04.00 (Agilent Technologies) y se obtuvo el área de pico. Se realizó un análisis estadístico no paramétrico Mann-Whitney, con un 95% de nivel de confianza y previa detección de outliers mediante el método ROUT (valor Q = 5%). Para el análisis de correlaciones se empleó un test no paramétrico de correlación de Spearman, todo ello mediante el programa GraphPad Prism (versión 6.01).
Resultados y discusiónOxalacetato, guanidoacetato y 3-ureidopropionato muestran niveles inferiores en el grupo de individuos con microalbuminuria (M) respecto a aquellos en la condición de normoalbuminuria (N). El malato, en cambio, muestra niveles superiores en M respecto a N (fig. 1). Estos datos confirman observaciones previas en pacientes con albuminuria, bien desarrollada durante los 3 años de seguimiento previos a la toma de muestra (albuminuria de novo) o ya presente con anterioridad (albuminuria mantenida)22. Cabe destacar que estos 4metabolitos son capaces de diferenciar entre los pacientes N y aquellos en el rango de albuminuria NA y, por lo tanto, permiten una estratificación molecular más temprana de los pacientes.
Paralelamente se realizó un estudio de la correlación entre los niveles de los metabolitos en orina y los valores de ACR para cada paciente, en el que resultó en todos los casos una correlación estadísticamente significativa (fig. 2).
Se ha descrito un aumento del estrés oxidativo asociado al desarrollo de albuminuria29. El estrés oxidativo es causado por una desregulación en la producción y metabolismo de las especies reactivas de oxígeno, en cuya regulación intracelular participa el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Las alteraciones observadas en los niveles de oxalacetato y malato en pacientes con albuminuria en el rango normal-alta y microalbuminuria señalan nuevamente al metabolismo energético como una pieza clave en el manejo de los pacientes hipertensos30. El guanidoacetato es un intermediario en el metabolismo de la arginina y prolina y precursor de la creatina, un sustrato de la creatinquinasa. Esta enzima se ha relacionado con un fracaso del tratamiento antihipertensivo, sin conocerse en detalle los mecanismos que lo provocan31. Por otro lado, se ha propuesto el guanidoacetato como marcador de lesión renal: muestra un nivel reducido en la orina de pacientes trasplantados con función renal normal32. Las alteraciones de estos metabolismos señalan, por tanto, una desregulación temprana de los metabolismos de energía y de la arginina y prolina ya en pacientes con albuminuria en el rango normal-alta.
Como limitaciones del estudio cabe destacar diferencias en algunas de las características basales de los grupos clínicos comparados, en particular, en lo que se refiere al porcentaje de individuos diabéticos. Si bien es esperable una mayor presencia de diabetes mellitus en el grupo de sujetos con microalbuminuria, sería de interés evaluar en una mayor cohorte de sujetos únicamente no diabéticos las variaciones metabólicas observadas para determinar exactamente el grado de contribución de la diabetes.
ConclusionesEn este estudio hemos confirmado la asociación de los niveles de los metabolitos 3-ureidopropionato, oxalacetato, malato y guanidoacetato con distintos grados de albuminuria. Por vez primera, se ha identificado una huella molecular (panel metabólico) capaz de mostrar variación dentro de la condición de normoalbuminuria, distinguiendo entre sujetos con ACR < 10 mg/g o superior. Este hecho es destacable por cuanto que supone una herramienta con un enorme potencial en el manejo terapéutico de pacientes hipertensos con niveles de ACR considerados «no patológicos» y que, por lo tanto, no reciben una atención médica especial. Sin embargo, son estos pacientes los que más se beneficiarían de una intervención temprana, ya que presentan un mayor riesgo de enfermedad renal o cardiovascular.
FinanciaciónInstituto de Salud Carlos III-Fondos FEDER (PI16/01334, PI13/01873, PI17/01193, PI17/01093, IF08/3667-1, CPII15/00027, CP15/00129, PT13/0001/0013, PRB3 (IPT17/0019 ISCIIIS-GEFI/ERDF), REDinREN (RD16/0009)), Ayuda a la Investigación de la Fundación SENEFRO y Fundación Conchita Rábago de Jiménez Díaz.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
A Lucía Guerrero, Luisa Fernández y María Cruz Casal, del Hospital 12 de Octubre.
